大肠杆菌（E. coli）因其低成本和快速的表达速度，常被选为小分子细胞质蛋白或结构域表达的理想宿主。利用大肠杆菌生产蛋白质，主要步骤包括：首先，将编码目标蛋白的质粒导入细菌；然后，在细胞生长到适宜数量时诱导蛋白表达。在选择载体时，关键因素是启动子和工程化克隆位点。

常用的大肠杆菌表达载体分为两类：一类是E．coli RNA聚合酶转录的，如pGEX、pMAL、pTrcHis、pBAD和pQE系列；另一类是T7 RNA聚合酶转录的，如pET、pETduet、pREST、pTriEX和pQE。启动子的选择也十分重要，比如Lac启动子虽然不如Tac或Trc强，但通过高拷贝数载体可以实现蛋白表达；Tac启动子，如pGEX和pMAL系列，受乳糖操纵子调控；Trc启动子与Tac类似，但调控细节略有不同。

PBAD启动子基于ara操纵子，通过AraC蛋白的调控，适合特定条件下的表达。T7-lac启动子的pET系列载体需要宿主含有可诱导的T7 RNA聚合酶基因，如DE3菌株，使用低葡萄糖培养基可提高表达效率；T5-lac是另一种高效噬菌体启动子，能显著提高转录产量。