企业申请在新三板挂牌的费用主要包括三部分：中介机构费用、全国股转系统公司费用以及中国证券登记结算有限公司股票登记费用。中介机构费用涵盖了主办券商推荐挂牌服务费、会计师审计及验资费用、资产费用、律师服务费用等。全国股转系统公司费用包括初始挂牌费、信息披露费用等。中国证券登记结算有限公司股票登记费用在企业完成股票登记时缴纳。

企业新三板挂牌后的年度费用则分为三部分：主办券商持续督导费用、年度审计费用和全国股转系统公司挂牌年费。主办券商持续督导费用是在会计师事务所出具年度审计报告后支付，以确保公司在挂牌后能持续提升规范运营水平。年度审计费用由具备证券从业资质的会计师事务所进行，费用在会计师事务所出具年度审计报告后支付。全国股转系统公司挂牌年费是公司在完成股票登记后，才具备在新三板进行股票交易流通资格的费用。

企业申请新三板和在挂牌后的费用是企业需要关注的重要问题，费用的构成主要包括中介机构费用、全国股转系统公司费用以及与股票登记和年度运营相关的费用。企业应全面了解这些费用，并在财务规划中考虑这些成本，以确保企业能合理规划财务，实现长期可持续发展。