摘要：和元生物利用AdMax系统在HEK293细胞中获取表达Oct-4-EGFP-3FLAG的重组腺病毒，经扩增、纯化、检测后留待后续功能学研究。关键词：AdMax，Oct-4，EGFP，重组腺病毒

一、实验原理

腺病毒是一种无包膜病毒，直径约70～90nm，基因组为线状双链DNA，全长约36kb，两端各含约100bp的反向重复序列。腺病毒广泛存在于多种哺乳动物和禽类中，对上皮细胞、角膜和消化道上皮细胞具有天然的侵嗜性。目前发现的51种人腺病毒被分为ABCDEF六个亚群，其中C亚群的第2和第5血清型最常用于构建腺病毒载体。腺病毒基因组分为编码区和非编码区，编码区分为早期基因区和晚期基因区，其中早期基因区细分为E1～E4四个区，负责编码调节蛋白，而晚期基因区分为L1～L5五个区，负责编码结构蛋白。早期表达的调节蛋白调控晚期基因表达，E1区基因先表达，其产物对腺病毒复制、包装及其他蛋白表达至关重要。非编码区含病毒进行复制和包装所需的顺式作用元件及DNA复制起始点，包含病毒包装信号。

二、实验目的

获取足够纯度和滴度的重组腺病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG

三、实验步骤

和元生物将目的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染至HEK293细胞中，重组获得病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG。步骤包括病毒包装与鉴定、病毒大量扩增与纯化、病毒滴定测定与目的基因表达检测。

1. 病毒包装与鉴定

- 细胞准备：在转染前一天，接种细胞至6孔板，控制细胞密度为70-80%。

- 转染：转染前一小时去除细胞培养基，加入Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。

- 质粒与转染试剂复合物制备：将穿梭质粒与骨架质粒配比1:1溶于Opti-MEM培养基，配制转染试剂，形成稳定的转染复合体。

- 转染：将复合体加入细胞培养板，培养6小时后，吸去培养基，加入新鲜完全培养基，每隔三天换液一次，待出现病毒空斑后收集上清液。

2. 病毒大量扩增与纯化

- 细胞铺板：将HEK293细胞铺至30-40个10cm dish，感染病毒，收集细胞裂解物，离心，收集上清，加入病毒沉淀液，冰上放置沉淀病毒，离心收集病毒悬浮液，透析后于-80℃保存。

3. 病毒滴定测定

- 选取状态良好的HEK293细胞，准备病毒样品，稀释后加入24孔板，感染细胞48小时，固定，封闭，一抗、二抗孵育，检测阳性细胞，计算病毒滴度。

4. 目的基因表达检测

- 感染293T细胞，WB检测病毒表达，确定感染MOI，收集样品进行WB检测。

四、实验结果

包装荧光拍照质控结果显示细胞完全病变。Adeno-Oct-4-EGFP滴度结果为6.32×1010 Ifu/mL。包装后的腺病毒可用于后续功能学研究。

五、腺病毒包装及使用注意事项

- 关于腺病毒滴度单位、保存、稀释方法、体内试验的腺病毒使用建议与和元生物动物实验中心的腺病毒技术工程师分享经验。