接上版,其他的血液细胞分离方法
在血液细胞分离技术中,嗜碱性粒细胞的分离通常采用Percoll密度梯度离心分离法。这一方法首先需配制Percoll混悬液,其包括Percoll、HBSS、HEPES和HCL等成分,确保PH值为7.4。然后,将这三种不同浓度的Percoll液层倒入离心管中,形成三个不同密度的梯度层。新鲜的抗凝血,通过0.1mol/EDTA PH 7.7进行抗凝处理,按等体积加入Percoll密度梯度分层液上,于室温下以1200r/min的转速离心25分钟。之后,将每一层细胞分别移入试管内,用无Ca,Mg离子的Hanks液进行3次洗涤,每次1200r/min离心10分钟,去除上清。最后,涂片、固定后用Wright-Giemsa染液染色,检查嗜碱性粒细胞,其染色为紫红色。
外周淋巴血细胞的分离则采用Ficoll密度梯度离心法。首先,用肝素抗凝的静脉血与Hank’s液按一定比例稀释,注意操作轻柔,确保两层界面清晰。在25度的条件下,以2000rpm离心20分钟。离心后,吸取中间白色云雾状的狭窄带,置于另一试管中,加入Hank’s液洗涤,离心1600rpm 8分钟,重复2次。之后,对细胞进行计数,并以一定浓度种到培养板中,加入营养液培养。
对于外周淋巴细胞的分离,首先将抗凝血缓慢加入淋巴细胞分离液上,以5ml生理盐水稀释血样。在室温下以500g离心20分钟。取中间的云雾状白色杂带,置于另一50ml离心管中。然后,用PBS洗涤,如混有红细胞,可使用红细胞裂解液进行处理。接着,以1000 rpm离心10分钟,重复操作。细胞以10%胎牛血清+RPMI1640重悬后,计数并调整至10ml进行培养。如果需要冻存,按照指定的冻存液(10%DMSO+20%胎牛血清+RPMI1640)操作,确保细胞在低温环境中得到妥善保存。
单核细胞的分离方法中,将抗凝血用等体积生理盐水稀释后加入Ficoll Hypaque分离液表面,以450 g离心25分钟收集单个核细胞。这些细胞用10小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮,置于6x 6 cm玻璃培养皿中,在5%CO2、37℃下孵育2小时。收集贴壁的单核细胞,用0.2乳白蛋白的RPMI-1640培养液悬浮,Wright染色计数单核细胞,确保比例小于95%。调整细胞密度至4×10/ml后,加入细胞悬液于24孔培养板中,在5%CO2、37℃下培养24小时,离心收集上清液,用于后续实验。
在单个血小板的分离和保存过程中,首先在无菌操作下穿刺肘中静脉取血,使用2%EDTA (1:9)进行抗凝处理。然后,通过100 ×g离心10分钟,获得富血小板血浆(PR
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